Ujian Semester

1.      Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak!

Jawab

Triterpenoid merupakan senyawa golongan terpen telah diisolasi dengan lebih dari 40 jenis kerangka dasar yang sudah dikenal dan pada prinsipnya merupakan proses siklisasi dari skualen. Proses biosintesis untuk memperoleh senyawa triterpenoid jalur mevalonat diawali dengan reaksi kondensasi dua molekul asetil-koenzim A (asetil-CoA) menjadi asetoasetil-CoA yang dikatalisasi oleh enzim asetil-CoA asetiltransferase. Selanjutnya asetoasetil-CoA berkondensasi lagi dengan satu unit asetil-CoA lainnya untuk membentuk molekul β-hidroksi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) yang dikatalisasi oleh enzim HMG-CoA sintase (Goldstein and Brown,1990). Proses kedua adalah reduksi HMG-CoA oleh NADPH dengan katalisasi oleh enzim HMG-CoA reduktase menjadi asam mevalonat (MVA, Dewick, 1997).

Pada proses berikutnya, dengan bantuan enzim mevalonat kinase dan enzim fosfomevalonat kinase, asam mevalonat dikonversi menjadi asam-5-pirofosfo-3-fosfomevalonat. Selanjutnya enzim pirofosfomevalonat dekarboksilase akan bekerja untuk merubah asam-5- pirofosfo-3-fosfomevalonat menjadi isopentenil pirofosfat (IPP). Dalam proses selanjutya IPP dengan bantuan enzim IPP isomerase akan membentuk reaksi kesetimbangan menjadi dimetilalil pirofosfat (DMAPP). Kondensasi IPP dan DMAPP yang akan membentuk geranil pirofosfat (GPP, C-10) dan farnesil pirofosfat (FPP, C-15) yang dikatalisasi oleh geranil pirofosfat sintase dan fenesil pirofosfat sintase berturut-turut (Burke et al., 1999).

Reaksi-reaksi selanjutnya dari senyawa antara GPP, FPP untuk menghasilkan senyawa-senyawa terpenoid satu persatu hanya melibatkan beberapa jenis reaksi sekunder, lazimnya ialah hidrolisa, siklisasi, oksidasi, reduksi dan reaksi-reaksi spontan yang dapat berlangsung dengan mudah dalam suasana netral dan pada suhu kamar, seperti isomerisasi, dehidrasi, dekarboksilasi dan sebagainya.

 

Berikut, melalui reaksi sekunder seperti siklisasi pembentukan senyawa triterpenoid golongan terpen, yang mempunyai rumus molekul secara umum yaitu, C₃₀H₄₂ tersusun atas 6 unit isopren.

 

Faktor yang sangat penting dihasilkannya senyawa triterpenoid dalam kuantitas banyak:Pada proses biosintesis enzim-enzim yang bekerja, pH dan temperatur menjadi faktor penting keberhasilan terbentuknya senyawa hasil proses biosintesis seperti, senyawa triterpenoid.Untuk memperoleh kandungan senyawa bioaktif pada tumbuhan faktor penting yang harus diperhatikan adalah cara pengambilannya dengan menggunakan metode-metode pemisahan yang ada, seperti metode maserasi, destilasi, dekantasi, sentrifugasi, sokletasi, metode ekstraksi dan lain sebagainya. 
Pelarut yang digunakan dalam proses pengambilan senyawa juga menjadi faktor penentu. Pelarut yang sesuai dan baik akan menghasilkan senyawa hasil yang baik juga. Untuk senyawa terpenoid pada umumnya larut dalam lemak dan pelarut organik seperti eter dan alkohol. Kebanyakan golongan senyawa triterpenoid pelarut yang digunakan adalah n-heksan dan etil asetat.

2.      Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda!

Jawab

Pada umumnya setiap poses isolasi suatu senyawa bahan alam dilengkapi dengan penentuan struktur dari senyawa yang dihasilkan dari proses isolasi tersebut. Karena dari isolasi menggunakan metoda standar tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut. Sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air. Beberapa metoda standar identifikasi dan elusidasi struktur yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia termasuk derivat-derivatnya antara lain: metoda spektroskopi (UV, IR, NMR, massa) dan metoda kromatografi (KLT, kromatografi gas, kolom, dan cair)  (Silverstein, 1991).

Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene  (C₆) terikat pada suau rantai propane (C₃)  sehingga  membentuk  suatu  susunan  C₆-C₃-C₆.  Susunan  ini  dapat menghasilkan tiga jenis struktur, yakni  1,3-diarilpropana atau flavonoid,  1,2-diarilpropana atau isofalvonoid, dan 1,1-diarilpropana atau neoflavonoid.

Senyawa-senyawa flavon mempunyai  kerangka  2-fenilkroman,  dimana  posisi  orto  dari cincin A dan atom karbon yang terikat pada cincin B dari  1,3-diarilpropan dihubungkan  oleh  jembatan  oksigen,  sehingga  membentuk  suatu  cincin heterosiklik yang baru (cincin C).

 

Berikut dua contoh penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR:

Ekstraksi terhadap serbuk daun puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) dengan menggunakan etanol diperoleh ekstrak kasar etanol. Setelah dilakukan uji fitokimia dengan menambahkan serbuk Mg dan HCl pekat maka ekstrak tersebut menunjukkan warna merah yang menandakan adanya kandungan flavanoid. Karakterisasi inframerah senyawa spektrum (IR) hasil isolasi memperlihatkan pita serapan pada angka gelombang 3431, 3111, 3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm^-1 dan spektrum ¹H-NMR memperlihatkan adanya pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3 dan 7,6 ppm.

Analisis spektrum inframerah (IR) hasil isolasi menunjukkan pita serapan pada angka gelombang 3431 cm^-1 yang merupakan serapan dari regang O─H dengan bentuk pita yang agak lebar. Pita serapan diatas 3000 cm^-1 menunjukkan adanya regang C─H aromatis dimana pada spektrum senyawa hasil isolasi muncul pada angka gelombang 3111 dan 3057 cm^-1. Pita serapan pada angka gelombang 1618 cm^-1 menunjukkan adanya regangan C═O dengan pita serapan yang kuat. Pita serapan pada angka gelombang 1475 dan 1300 cm^-1 meupakan lentur C─H alifatik dan pita serapan pada angka gelombang 1462 cm^-1 menunjukkan absorpsi dari metil dan metilena. Daerah pada angka gelombang 1000-650 cm^-1 memberikan informasi tentang sifat khas alkena dan posisi substitusi pada cincin aromatis dimana pada spektrum IR muncul pita serapan pada angka gelombang 970 cm^-1 yang menandakan adanya alkena dalam bentuk trans dan pita serapan pada angka gelombang 800 cm^-1 menandakan aromatik meta.

Analisis spektrum ¹H-NMR senyawa hasil isolasi terlihat adanya beberapa kelompok proton dengan pergeseran kimia yang berbeda-beda. Pada pergeseran kimia 1,5 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton alifatik atau proton OH yang diperkuat oleh spektrum IR pada angka gelombang 3431cm^-1. Adanya sinyal multiplet pada pergeseran 6,3 ppm menunjukkan adanya alkena disertai pembelahan pada jarak jauh. Pada pergeseran kimia 7,6 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton-proton cincin aromatik. Sinyal-sinyal yang muncul pada pergeseran kimia 6,0-8,0 ppm merupakan sinyal untuk proton-proton aromatik.

Dari analisis spektrum IR dan ¹H-NMR dan uji fitokimia dapat disimpulkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa aromatis atau fenolik dan diperkirakan merupakan suatu jenis senyawa flavanoid.

Sebanyak 980 gram serbuk halus batang tumbuhan paku Nephrolepis radicans (Burm.) Kuhn dimaserasi menggunakan pelarut metanol sebanyak 3 kali masing-masing selama 24 jam pada suhu kamar. Hasil maserasi kemudian disaring secara vacuum menggunakan penyaring Buchner dan filtratnya diuapkan dengan rotary vacuum evaporator sampai terbentuk ekstrak pekat. Ekstrak pekat yang diperoleh diuji dengan FeCl₃ dan shinoda test sebagai uji pendahuluan bahwa ektrak yang diperoleh merupakan senyawa flavonoid.

Spektrum IR (KBr) maks : 3222 (OH), 2930 (C-H alkil), 1633 (C=O), 1513, 1460 (C=C aromatik), 1385 (tekuk C-H alkil), 1269 (-C-O-C-), 1026 (C-O simetris), 666,3 cm-1 (lentur pendukung aromatik).

Adanya gugus fenol juga didukung oleh munculnya puncak dalam spektrum IR pada daerah 3222,5 cm^-1 (vibrasi ulur OH) dan 1513,4; 1460,9 cm^-1 (vibrasi ulur C=C aromatik).

Hasil pengukuran spektrum UV isolat dalam pelarut metanol yang menunjukkan serapan maksimum pada λmaks 280,3 nm (pita II) dan bahu pada daerah 333 nm (pita I), mendukung bahwa isolat merupakan flavonoid jenis dihidrocalkon. Serapan OH (3222,5 cm-1 ), C-H alkil (2930,1 cm–1), C=O terkelasi (1633,3 cm-1), C=C aromatik (1513,4 cm-1, 1460,9 cm-1) dalam spektrum IR mendukung bahwa isolat merupakan flavonoid jenis dihidrocalkon.

3.      Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid!

Jawab

Kebanyakan alkaloid bersifat basa. Sifat tersebut tergantung pada adanya pasangan elektron pada nitrogen. Jika gugus fungsional yang berdekatan dengan nitrogen bersifat melepaskan elektron, contoh gugus alkil maka ketersediaan elektron pada nitrogen naik dan senyawa lebih bersifat basa. Sebaliknya bila gugus fungsional yang berdekatan bersifat menarik elektron, contoh gugus karbonil maka ketersediaan elektron berpasangan berkurang dan pengaruh yang ditimbulkan alkaloid dapat bersifat netral atau bahkan sedikit asam (Harjono, 1996).

Alkaloid biasanya diisolasi dari tumbuhannya dengan menggunakan metode ekstraksi. Pelarut yang digunakan ketika mengekstraksi campuran senyawanya yaitu molekul air yang diasamkan. Pelarut  ini akan mampu melarutkan alkaloid sebagai garamnya.

Selain itu juga dapat membasakan bahan tumbuhan yang mengandung alkaloid dengan menambahkan natrium karbonat untuk di ekstraksi dengan pelarut  organic seperti seperti kloroform atau eter.

Untuk alkaloid yang bersifat tidak  tahan panas, isolasi dapat dilakukan menggunakan teknik pemekatan dengan membasakan larutannya terlebih dahulu. Dengan menggunakan teknik ini maka alkaloid akan menguap dan selanjutnya dapat dimurnikan dengan metode penyulingan uap.

Larutan dalam air yang bersifat asam dan mengandung alkaloid dapat dibasakan dan alkaloid diekstaksi dengan pelarut organik sehingga senyawa netral dan asam yang mudah larut dalam air tertinggal dalam air. Cara lain untuk mendapatkan alkaloid dari larutan yang bersifat basa adalah  dengan metode penjerapan menggunakan pereaksi Lloyd. Alkaloid yang diperoleh kemudian dielusi dan diendapkan menggunakan Pereaksi Meyer. Setelah  itu, endapan yang terbentuk dipisahkan  menggunakan  metode kromatografi pertukaran ion.

Berikut tiga contoh isolasi macam-macam alkaloid:

Bagian daun tumbuhan jambu Keling (Eugenia cumini (L) Druce) didestruksi basah dengan HCl dalam metanol sebesar 2M kemudian dinetralisasi dengan penambahan basa NH₄OH dan terjadi padatan berupa endapan. Endapan dikeringkan dan diektraksi dan direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rota-evaporator. Ekstrak pekat khloroform (2 g) dikhromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 sebanyak 60 gram dengan fasa gerak khloroform: metanol dengan menaikkan kepolaran bertingkat. Fraksi yang keluar kolom khromatografi ditampung menggunakan vial serta dimonitor dengan khromatografi lapis tipis. Fraksi dengan Rf yang sama dan positip dengan pereaksi Maeyer yang ditandai dengan munculnya warna putih, digabung selanjutnya, diuapkan pelarutnya kemudian fraksi ini direkristalisasi untuk memperoleh kristal murni. Kristal yang dihasilkan berwarna kuning dengan titik leleh 293 oC – 295 oC. Dimana setelah dilakukan uji spektrum IR dan NMR menunjukkan struktur golongan alkaloid indol.

Ekstraksi kafein dari teh,  25 gram daun  teh kering dan 20 gram natrium karbonat (NaHCO₃)  dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer 250 mL, kemudian tambahkan 225 mL air mendidih, lalu didekantasi. Ekstrak teh didinginkan hingga suhu kamar, kemudian lakukan ekstraksi dengan penambahan 30 mL diklorometana. Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali dengan pelarut diklorometan dengan jumlah yang sama. Ekstrak diklorometana dan  semua fraksi yang berwujud emulsi digabungkan di dalam labu Erlenmeyer 125 mL, kemudian  tambahkan kalsium klorida anhidrat ke dalam gabungan ekstrak dan emulsi. Kemudian, ekstrak diklorometana disaring, filtrat digabung dan lakukan distilasi menggunakan penangas air untuk menguapkan diklorometana. Produk yang terbentuk ditimbang dan dilakukan  rekristalisasi menggunakan 5 mL aseton panas.  Masih  dalam  keadaan  panas,  tambahkan n-heksana tetes demi tetes sampai  terbentuk  kekeruhan. Dinginkan sampai  mencapai  suhu kamar, kemudian kristal yang terbentuk disaring dengan penyaringan isap (vakum). Kristal dicuci dengan  beberapa  tetes  n-heksana.  Diperoleh kristal murni dan kemudian  dilakukan  pengujian titik leleh.

Isolasi nikotin dari daun tembakau, dipotong-potong 10 gram daun tembakau kering atau tembakau dari cerutu. Ditambahkan 100 ml larutan NaOH 5% dan 30 ml air, diaduk. Disaring menggunakan corong Buchner. Untuk menghilangkan partikel (daun tembakau) dalam hasil saringan(filtrate), filtrate disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glasswool. Filtrat ditambahkan 30 ml diklorometan, dikocok. Dipisahkan lapisan diklorometan ke dalam labu Erlenmeyer. Langkah ekstraksi ini dilakukan sampai semua nikotin terekstrak ke dalam diklorometan. Dikumpulkan semua lapisan diklorometan. Diuapkan diklorometan menggunakan rotary vacuum evaporator. Penguapan diklorometan atau eter dilakukan menggunakan teknik  penguapan dengan pengurangan tekanan dan jangan menggunakan api. Ditambahkan 1ml air suling ke dalam sisa penguapan, aduk perlahan-lahan, ditambahkan 4ml methanol, disaring dengan menggunakan corong gelas yang diberi glass wool. Ditambahkan 10 ml larutan jenuh asam pikrat dalam methanol. Disaring nikotin dipikrat padat menggunakan corong Buchner (digunakan kertas saring). Dimurnikan nikotin, dengan rekristalisasi dan diperolh kristal murni.

4.      Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya!

Jawab

Biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur merupakan satu kesatuan dalam mempelajari senyawa bahan alam. Dimana biosintesis merupakan pembentukan suatu senyawa bahan alam didalam suatu tumbuhan/makhluk hidup, seperti flavanoid, steroid, alkaloid, terpenoid dan lain sebagainya. Pada umumnya dibantu oleh suatu enzim dalam temperatur tertentu. Senyawa-senyawa hasil biosintesis banyak dimanfaatkan dalam kehidupan sehari-hari. Untuk memperoleh senyawa yang terkandung dalam suatu tumbuhan/makhluk hidup dilakukan proses isolasi, yaitu pemisahan suatu senyawa yang diinginkan dari suatu sampel. Senyawa hasil proses isolasi ditentukan strukturnya. Penentuan struktur ini dimaksudkan untuk mengetahui jenis/nama senyawa yang dihasilkan.

Contohnya:

Pada senyawa terpenoid, salah satu proses biosintesisnya melalui jalur mevalonat seperti yang telah dijelaskan diatas pada jawaban pertanyaan nomor 1  (satu). Tahap akhir dari proses tersebut menghasilkan suatu senyawa dimetilalil pirofosfat (DMAPP) dan isopentil pirofosfat (IPP) yang kemudian akan bereaksi menghasilkan geranil pirofosfat (GPP) dan farnesil pirofosfat (FPP), yang merupakan senyawa awal untuk pembentukan senyawa turunan terpenoid seperti golongan monterpen, diterpen, triterpen dan lainnya.

Proses isolasi dilakukan untuk mengambil senyawa yang diinginkan dari suatu sampel tumbuhan/ makhluk hidup.

Limonena merupakan salah satu jenis terpenoid golongan monoterpen yang terdapat dalam minyak atsiri terkandung di dalam kulit jeruk.

 

Untuk memperoleh senyawa limonena yang terkandung dalam minyak atsiri pada kulit jeruk dilakukan proses isolasi. Tahapan isolasi senyawa limonena pada minyak atsiri sebagai berikut;

 

Setelah dilakukan proses isolasi dari kulit jeruk dihasilkan suatu ekstrak senyawa hasil yang berupa minyak atsiri. Untuk menentukan senyawa apa yang terdapat dalam minyak atsiri, maka dilakukan penentuan struktur. Berikut data spektrum infra-merah minyak atsiri senyawa D-Limonena.

Minyak atsiri (cm-1)	D-Limonena (cm-1)	Keterangan
1635,3	1647,1	C=C
1455,8	1465,8	CH2 bending
2854,5	2854,5	C-H streching CH3
1377,1	1363,6	C-H bending simetris CH3

Berdasarkan data pada tabel diatas analisa spektrum IR minyak atsiri sudah dipastikan mengandung senyawa limonena. Hal ini dilihat dari pita serapan yang di tunjukkan, antara minyak atsiri dan pita serapan limonena berdasarkan literatur sama dan tidak memiliki perbedaan yang bearti.